định lượng strychnin trong hạt mã tiền

Hợp Dồng Mẫu Trong Buôn Bán Quốc Tế. - Hợp đồng này chịu sự điều tiết của những quy định trong Incoterms 2000 (the contract will be governed by the provision of Incoterms 2000). Những hợp đồng không dẫn chiếu đến Incoterms thường có quan niệm Hạt Mã tiền (Strychnos rĩux vomica L) thu hái ở rừng núi gần Thị xã Chum KiRy, tỉnh KamPot, Campuchia vào tháng 03 năm 2011. Hàm lượng strychnin trong hạt mã tiền là 2 ,01 %. 2.1.2. Hóa chất và dung môi. - Vôi bột pha thành sữa vôi - dd Na2CƠ3 bão hóa - dd H2SO4 0,5 % , H2SO4 3% - dd H N O 3 3 % Dược liệu Mã Tiền giống quả cam6. Thành phần hóa học Mã Tiền. Hạt Mã tiền có chứa các alcaloid chính là strychnin, brucin và các alcaloid -B-colubrin vomicon, novacin, icagin và loganin. Strychnin là một chất độc. 7. Phân biệt thật giả … 8. Công dụng – Tác dụng Vay Tiền Trả Góp Theo Tháng Chỉ Cần Cmnd. m BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC D ươc HÀ NÔI ĐỖ THỊ HÀ 16. ý o p c 1'í' Tff .\ IH Ư -V IE S lĩ-c n k NGHIÊN CỨU CHIẾT STRYCHNIN SULFAT BANG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩK H O Ả 2000 - 2005 - Ngưòi hướng dẫn PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị - Nơi thực hiện Bộ môn Công nghiệp dược Trường ĐH Dược Hà Nội - Thòi gian thực hiện Tháng 02 - 05/2005 HÀ NỘI, 05 - 200p f . rtt w & Ị v_ M \U - Á LỜI CẢM ƠN Trong 3 tháng thực hiện khoá luận, vói sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo và các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp “ Nghiên cứu chiết strychnin sulfat bằng ethanol Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới - PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. - Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Hà Nội, ngày 28/05/2005. SINH VIÊN Đỗ Thị Hà MỤC LỤC Trang CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 01 PHẦN 1 - TỔNG QUAN 02 â y Mã tiền 02 Đặc điểm thực vật 02 Phân bố và sinh thái 03 - Bộ phận dùng và thành phần hoá học 04 n g dụng 05 -Strychnin 06 Công thức hoá học 06 - Tính chất 06 - Định tính, định lượng 08 - Tác dụng dược lý và ứng dụng 08 1 .3 - 09 Các phương pháp chiết xuất alcaloid guyêntắc chung 09 - Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 13 1 .5 - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền 13 - Phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam 13 - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói 14 PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 15 - Nguyên vật liệu 15 2 .1 .2 - 15 Phương pháp thực nghiệm - Kết quả thực nghiệm và nhận xét 22 Định lượng strychnin trong nguyên liệu hạt mã tiền 22 - Chiết xuất strychnin bằng ethanol 25 - Chiết xuất strychnin bằng dầu hoả 34 - Kiểm nghiệm thành phẩm strychnin sulíat 37 PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 3 .1 - Kết luận 40 - Đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT - Bh Bão hoà - Dd Dung dịch - Dm Dung môi - DĐVN Dươc Điển Viêt Nam ĐẶT VẤN ĐỀ Alcaloid là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt, đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. Strychnin là một alcaloid được dùng trong điều trị với tác dụng chính là kích thích thần kinh trung ương, mặc dù hiện nay strychnin ít được dùng trong điều trị nhưng lại rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cách tác dụng của các thuốc chống co giật [6]. Hiện nay ở nước ta, xí nghiệp dược phẩm trung ương II đang chiết strychnin bằng dầu hoả. Dung môi này có ưu điểm là chiết chọn lọc nên dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế và cho hiệu suất cao. Tuy nhiên do độ tan của strychnin trong dung môi này rất thấp nên phải chiết nóng ở 100°c do đó đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng nồi hơi, nồi chiết 2 vỏ, đồng thcd dầu hoả là dung môi dễ cháy. Các điều kiện chiết xuất này không phải cơ sở nào cũng đáp ứng được. Trong phương pháp chung để chiết alcaloid thì ngoài chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ không phân cực còn có phương pháp chiết alcaloid bằng các dung môi phân cực nước hoặc các dung môi trộn lẫn vói nước. Ở Việt Nam, ethanol là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm. Ethanol có khả năng hoà tan alcaloid ở cả dạng base lẫn dạng muối. Nhược điểm của ethanol là dung môi không chọn lọc với alcaloid, nó hoà tan nhiều tạp chất khác như sắc tố, nhựa làm cho quá trình tinh chế khó khăn. Tuy nhiên hạt mã tiền có thể sử dụng ethanol để chiết vì nó chứa ít tạp sắc tố, nhựa nên không ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. Mặt khác độ tan của strychnin trong ethanol rất cao, nên có thể chiết ở nhiệt độ thường. Chúng tôi đặt vấn đề “nghiên cứu chiết strychnin bằng ethanol” và so sánh với phương pháp chiết bằng dầu hoả để có thể thực hiện chiết strychnin từ hạt mã tiền với các thiết bị đơn giản mà vẫn đảm bảo hiệu suất chiết so vói chiết bằng dầu hoả. Mục tiêu của khoá luận là - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin sulíat bằng ethanol, xác định các thông số chiết xuất Độ cồn, nhiệt độ, thời gian. - So sánh hiệu suất chiết xuất strychnin sulíat bằng hai phương pháp chiết xuất vói dm ethanol và dm dầu hoả. 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN - Cây Mã Tiền Strychnos nux-vomica L. - Đặc điểm thực vật +Strỵchnos nux - vomica L.\ Cây Mã tiền. Cây gỗ, thân đứng, cao 5 - 12m. v ỏ màu xám có lỗ bì. Cành nhẩn, không có móc, đôi khi có gai ở kẽ lá. Lá mọc đối, gốc tù đầu nhọn, dài 6 - 12m, rộng 3,5 8,5cm, nhẵn và dai, mặt trên xanh bóng có 5 gân hình cung nỗi rõ ở mặt dưới. Cụm hoa hình ngù mọc đối ở đầu cành, có 1 - 2 đôi lá có lông mịn. Hoa nhỏ hình ống, màu trắng hoặc vàng nhạt, có 5 cánh hoa hàn liền thành một ống dài 1 - l,2cm, nhị 5, dính ở phía trên ống tràng. Bầu hình trứng nhẵn. Quả thịt hình cầu, đường kính 3 5cm, vỏ cứng, nhẵn bóng, khi chín màu vàng cam chứa cơm quả màu trắng và 1 - 5 hạt hình đĩa dẹt, đường kính 2 - 2,5cm, dày 4 - 4,5mm, một mặt lồi, một mặt lõm có lông mượt toả đều từ giữa ra màu xám bạc. [4, 6] Mùa hoa tháng 3 - 4 . Mùa quả tháng 5 - 8 . Ngoài cây Mã tiền Strychnos nux-vomica L. ở nước ta còn có một số loài mã tiền dây leo thân gỗ khác ♦ Strychnos vanprukii Craib. = s. quadrangularìs Hill., s. nitida Gagnep. mã tiền cành vuông, dây vuông. Dây leo, thân gỗ, dài 5 - 20m, có móc, xếp từng đôi một, vỏ thân màu nâu. Cành non có 4 cạnh nhẵn. Lá hình mác, mọc đối, màu xanh bóng, dài 7 - 12cm, rộng 2,5 - 5,5cm, gốc thuôn, đầu nhọn, có 3 gân, gân phụ nhiễu tạo thành mạng xít nhau. Cụm hoa hình chuỳ dài 2 - 4cm, mọc ở kẽ lá. Hoa mẫu 5, tràng màu vàng nhạt. Quả thịt hình cầu, đường kính 4 - 5cm, khi chín màu vàng cam có 1 - 6 hạt. [4, 7] ềStrỵchnos ignatii Bergius = s. hainanensỉs Merr et Chun cây đậu gió, dây gió. Dây leo, thân gỗ dài 5 - 20m, dựa vào cây khác bằng móc đơn ở kẽ lá. v ỏ thân màu nâu hoặc xám nhạt, có nhiều lỗ bì. Cành tròn nhẵn. Lá mọc đối, hình trứng hoặc thuôn, dài 6 - 17cm, rộng 3,5 - 7cm, đầu nhọn gốc tròn, hai mặt lá nhẵn có 3 2 gân toả từ gốc. Cụm hoa hình chuỳ mọc ở kẽ lá thường ở những lá đã rụng dài 2 2,5cm, cuống hoa có lông. Hoa mẫu 5, tràng màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả hình cầu, đường kính 6 - 20cm, khi chín màu vàng có 4 - 10 hạt, hình elip dẹt mặt lõm mặt lồi, phủ lông dài màu vàng xám, mép hạt có một đường gờ nổi chạy vòng. [4, 7] ♦ Strychnos axilỉaries Coỉebr. Mã tiền hoa nách. Cây nhỏ mọc đứng hoặc leo cao 5 - 20m, cành đen đen có móc đơn ở kẽ lá. Lá có phiến đa dạng hình tròn đến thon, dài 3 - 9cm, không lông trừ lông ở mặt dưới, gân chính 3, cuống dài 2 - lOmm, có lông hoặc không. Xim ở nách lá có lông, cuống hoa ngắn, đài cao lmm, tràng có ống cao 3,5mm, nhị 5, bầu không lông. Quả mọng hình cầu, đường kính 1 - 2cm, khi chín màu đỏ cam, có 1- 2 hạt không lông, đường kính 10 - 12mm. [4,7] +Strychnin umbellata Lour. Merr. Mã tiền hoa tán. Cây nhỡ đứng hoặc leo, không mấu, không gai, cành tròn không lông. Lá có phiến nhỏ, dài 2,5- 8cm, rộng 2 - 4,5cm, không lông, cuống dài 1 - 5mm, không lông. Chuỳ hoa ở nách lá và ngọn cành, dài 3 - 7cm, hoa mẫu 4 - 5 , đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả hình cầu, đường kính 1 - 2cm, có 1 - 3 hạt hình đồng tiền. [4, 7] iStrychnos cathayensis Merr. Mã tiền Trung Quốc, Mã tiền Cát Hải. Cây nhỡ, leo, mấu từng cặp, cành màu nâu có lông mịn. Phiến lá thon, dài 6 lOcm, rộng 2 - 4cm, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới mờ, có ít lông hay không lông. Có 3 gân từ gốc, cuống có lông mịn. Chuỳ hoa ờ nách lá và ở ngọn cành, cao 3 - 4 cm, trục có lông, hoa mẫu 5, đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả mọng, tròn, đường kính 1 - 2cm, có 3 - 7 hạt. [4, 7] Y học cổ truyền sử dụng hạt của các loài mã tiền này như hạt của cây Mã tiền Strychnos nux-vomica L., nhưng hàm lượng strychnin trong hạt của cây Mã tiền là cao nhất và là nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất strychnin. - Phân bố và sinh thái Chi Strychnos L. có khoảng 150 loài trên thế giới, ở Việt Nam có gần 20 loài, hầu hết là những cây dạng bụi trườn, dây leo gỗ và chỉ có ít loài là cây gỗ trong đó có cây Mã tiền. [6] 3 Cây Mã tiền phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Bắc Malaysia, Mianma, Thái Lan, Bắc úc, Lào, Camphuchia, Việt Nam. Ở Việt Nam, cây Mã tiền chỉ thấy mọc hoang ở các vùng rừng núi phía nam, nhiều nhất ở Khánh Hoà, Bà rịa-Vũng Tàu, Bình Thuận, Ninh Thuận, Gia Lai và Đắc Lắc. Các loài Mã tiền khác phân bố ở hầu khắc các tỉnh miền núi nước ta Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình, Bắc Giang, Sơn La, Nghệ An, Quảng Trị...đặc biệt có nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Thuận Hải, Đồng Nai, Kiên Giang, riêng loài strychnos cathayensis Merr. mới gặp ở tỉnh Quảng Trị. [4, 6] Sinh thái Mã Tiền thuộc loại cây nhiệt đới điển hình. Cây thích nghi ở vùng có nhiệt độ trung bình năm 24 - 26°c trở lên. Cây ưa sáng, chịu được khí hậu khô nóng, thường mọc ở rừng thưa, rừng nửa rụng lá hoặc rừng kín thường xanh ở đai thấp, dưới 500 m. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm. Cây có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặt. Ở các vùng đồi ven biển thuộc tỉnh Khánh Hoà, Đồng Nai...có đến trên 50% là cây chồi. Cây mọc từ hạt phải sau 7 - 1 0 năm mới có hoa quả. [6] - Bộ phận dùng và thành phần hóa học - Bộ phận dùng Hạt, thu hái từ quả chín, đã phơi hoặc sấy khô. Loài Strychnos nux - vomica L. hạt hình đĩa dẹt, hơi dày lên ở mép, một số hạt hơi méo mó, cong không đều, đường kính 1,2 - 2,5cm, dày 0,4 - 0,6cm, hoi bóng, màu xám nhạt đến vàng nhạt. Hạt không mùi, vị rất đắng. [5] - Thành phần hoá học Hạt Mã tiền Strychnos nux - vomica chứa nhiều chất thuộc các nhóm -Acaloid 2-5% Strychnin chiếm gần 50%, còn lại chủ yếu là brucin, còn khoảng 2-3% là các alkaloid phụ khác như a-colubrin, P-colubrin, vomicin, novacin, pseudo strychnin...[4] 4 Strvchnin Rị = Rọ = -H Brucin R , = R 2 = -OCH3 oc-colubrin R , = H; R2 = -OCH3 p-colubrin Rị = OCíỉ3; R2 = -H. Ì a ^ n -cm , Rị = R2 = -0 CH3 R3 = -H N o v a xin =R2 = -H NH Ỵ Ỵ A cr ^ 'o - ^ o Pscudosừychnin Ngoài alcaloid, trong hạt còn có chất béo 4 - 5%, acid igasuric = acid clorogenic, acid loganic, stigmasterin, cycloarteroi và một glycozit là loganin = loganozit Loganin có nhiều trong cơm quả. Trong lá có khoảng 2% và trong vỏ thân trên 8% alkaloid nhưng chủ yếu là brucin. Các loài mã tiền khác hiện nay đang khai thác có tỷ lệ alkaloid toàn phần cũng như tỷ lệ strychnin khác nhau. Hạt mã tiền sử dụng làm thuốc phải chứa không ít hơn 1,2% strychnin tính theo dược liệu khô kiệt. [5] - ứng dụng Hạt mã tiền được dùng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại. 5 Y học cổ truyền sử dụng hạt mã tiền đã qua chế biến gọi là mã tiền chế để chữa tiêu hoá kém, ăn uống không biết ngon, phong thấp nhức mỏi tay chân, bại liệt, liệt nửa người, di chứng bại liệt trẻ em, trị đau dây thần kinh, liệt do rượu, liệt não do có nguồn gốc tuỷ, tiêu khí huyết tích tụ trong bụng. Mã tiền chưa chế thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi tay chân do thấp khớp, đau dây thần kinh, sử dụng dạng cồn thuốc, dùng riêng hoặc phối hợp với ô đầu phụ tử. Y học hiện đại Hạt mã tiền là nguyên liệu để chiết xuất strychnin. Strychnin thường dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat để chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, liệt dương, dùng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 6,7]. - Strychnin Strychnin thường được dùng dưói dạng strychnin sulfat. - Công thức hoá học .H2 C2iH22N20 22. H2S 0 4. 5H2ơ Phân tử lượng 856,93 Tên khoa học Strychnidin_10 on sulíat penta_hydrat. - Tính chất Lý tính Tinh thể hình kim không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị rất đắng. Bị mất nước kết tinh ở 100°c. Độ chảy khi khan khoảng 200°c bị phân huỷ. 6 Độ tan lg tan trong 35ml nước, 7ml nước sôi, 81ml ethanol, 26ml ethanol ở 60°c, không tan trong ether, khó tan trong cloroíorm. - Hoá tính ♦ Tính chất chung của alkaloid - Tính base yếu + Tác dụng với các acid tạo muối tương ứng Alcaloid = N + HC1 - ► [Alcaloid = N] . HC1 Muối Hydroclorid + Kết hợp với kim loại nặng Hg,Bi,Pt. •. tạo ra muối phức. - Phản ứng vái thuốc thử chung của alkaloid + Phản ứng tạo tủa Tạo tủa rất ít tan trong nước với các thuốc thử thuốc thử Mayer K2HgI4, thuốc thử Bouchardat iodo - iodid, thuốc thử Dragendorff KB1I4... Phản ứng tạo tủa rất nhạy, cho phép phát hiện có alkaloid trong dược liệu hay không. [4] Tạo tủa ở dạng tinh thể vói dung dịch vàng clorid, dung dịch Platin clorid, dung dịch nước bão hòa acid picric... [4] + Phản ứng tạo màu Ngoài phản ứng tạo màu vói các thuốc thử tạo màu chung của alcaloid như acid sulíuric đậm đặc d =1,84, acid nitric đậm đặc d =1,4, thuốc thử Frohde, thuốc thử Marquis, thuốc thử Mandelin...[4], strychnin còn có phản ứng tạo màu đặc biệt đó là phản ứng OTTO 7 Brucin không cho phản ứng này vì có nhóm - OCH3 khoá phản ứng. - Định tính, định lượng - Định tính Định tính strychnin sulfat theo DĐVNIII Có thể chọn một trong 2 nhóm định tính sau Nhóm 1 B, c và D. Nhóm 2 A và D. A Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của strychnin sulíat chuẩn. B Trong phép thử "tạp chất liên quan" vết chính của dung dịch thử phải giống về vị trí, màu sắc và kích thước so với vết chính của dung dịch đối chiếu. C Hoà tan 50mg chế phẩm trong 5ml nước, thêm 0,1 ml amoniac đậm đặc và chiết bằng 5ml cloroíòrm. Bốc hơi dịch chiết cloroíorm đến cạn trên cách thuỷ. Thêm vào cắn 0,1 ml acid sulíuric đậm đặc và một tinh thể Kali dicromat, xung quang tinh thể có màu tím, màu đỏ, màu vàng khi lắc. D Chế phẩm cho phản ứng của ion sulfat. - Định lượng Theo DĐVNIII. Hoà tan 0,500g chế phẩm trong 25ml acid acetic khan, thêm lm l alhydric acetic. Định lượng bằng dung dịch acid perclorid 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế hoặc bằng chỉ thị xanh malachit. lml dung dịch acid perclorid 0,1N tương đương với 76,70mg - Tác dụng dược lý và ứng dụng - Tác dụng dược lý Strychnin được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá vào máu cả trong huyết tương và hồng cầu, và nhanh chóng chuyển từ máu vào các mô. Strychnin kích thích tất cả 8 các phần của hệ thần kinh trung ương nhưng kích thích tương đối mạnh hơn trên tế bào vận động, đặc biệt là trên tuỷ sống theo cơ chế Trong synap của hệ thần kinh trung ương có hai loại receptor có chức năng đối lập nhau đó là receptor kích thích và receptor ức chế. Receptor glycin là một trong những loại chính của receptor ức chế và nó bị khoá bởi strychnin. Kết quả là các thông tin được truyền đi mạnh hơn rất nhiều trong cung phản xạ mà bình thường các thông tin này bị khử bởi tác dụng sau sinap của glycin. Strychnin kích thích những khả năng về trí não, làm tăng những cảm nhận về xúc giác, thính giác, vị giác và cơn đau. Strychnin kích thích tim mạch, làm tăng lượng epinephrine từ đó làm tăng huyết áp do sự kích thích trực tiếp của hệ thần kinh giao cảm trên cơ trơn động mạch. Tác dụng này rất có ý nghĩa trong điều trị một số bệnh tim mạn tính, đặc biệt trong bệnh viêm cơ tim. Nó cũng được coi là có ích trong điều tri giảm thị lực do ngộ độc, đặc biệt là ngộ độc nicotin. [6] Strychnin kích thích sự bài tiết nước bọt và dịch vị, tăng tốc độ chuyển của thức ăn sang ruột gây ra sự thèm ăn và giúp dễ tiêu. Tuy nhiên nếu dùng luôn sẽ gây ra biến loạn tiêu hoá, biến loạn co bóp dạ dày. [9] Strychnin liều nhỏ làm chậm mệt mỏi, tiếp theo là giai đoạn ức chế hoạt lực cơ. Strychnin được coi là có ích trong điều trị những bệnh co thắt khác nhau như múa giật, hen, động kinh. - ứng dụng Strychnin thường được dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, suy nhược, viêm dây thần kinh do nghiện rượu, say rượu cấp, đái dầm, liệt dương. Sử dụng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 7] - Các phương pháp chiết xuất alcaloid - Nguyên tắc chung Trong nhóm các hợp chất tự nhiên do alcaloid là nhóm chất có các đặc trưng lý hoá chung nên để phân lập chúng khỏi các nhóm hợp chất tự nhiên khác Aavonoid, coumarin, glycosid... thì có thể sử dụng một số phương pháp được gọi là các 9 phương pháp chung chiết xuất alcaloid và thu được hỗn hợp alcaloid toàn phần. Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần để tách riêng từng alcaloid ta phải dựa vào tính chất riêng của mỗi alcaloid mà có phương pháp thích hợp. sau Alcaloid base dễ tan trong dm hữu cơ, không tan trong nước, ngược lai alcaloid dưới dạng muối không tan trong dm hữu cơ và tan trong nước. [8] Như ta biết alcaloid có thể ở trạng thái rắn strychnin, morphin, codein... và ở trạng thái này trong phân tử thường chứa oxy. Ngoài ra, alcaloid có thể ở dạng lỏng nicotin, spactein,... và ở trạng thái này trong phân tử thường không có chứa oxy. Các alcaloid ở thể lỏng ngoài các phương pháp chung chiết xuất còn có thể chiết tách bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Với những alcaloid ở thể rắn người ta sử dụng hai phương pháp chiết xuất chung sau - Phương pháp chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu cơ a - Chiết alcaloid base bằng dm hữu cơ không phân cực - Giai đoan 1 Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô để tăng khả năng chiết ta phải xay nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán. Tuy nhiên nếu ta xay nhỏ dược liệu quá, dm sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và rất khó thu được dịch chiết do đó tuỳ thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau để vừa đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dễ dàng trong rút dịch chiết. Mặt khác nếu xay dược liệu nhỏ quá làm các tế bào bị dập nát nhiều, do đó dịch chiết sẽ kéo theo nhiều tạp chất ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. [1] Kiềm hoá Kiềm hoá và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm thường dùng CaOH2, NH4OH, Na2C 03... để chuyển alcaloid trong nguyên liệu sang dạng base. - Giai đoan 2 Chiết xuất Dùng dm hữu cơ không phân cực thích hợp, dm này hoà tan các alcaloid base vừa được giải phóng. Ở phòng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroíorm, ether hoặc hỗn hợp ether và cloroíorm. Có thể chiết nguội hoặc chiết nóng. [1,4] 10 - Giai đoan 3 Tinh chế Nguyên tắc Chuyển alcaloid nhiều lán từ dm hữu cơ sang dm nước và ngược lại w- -để loại các tạp chất không phải là alcaloid. Cuối cùng bốc hơi dm thu được hỗn hợp alcaloid base tinh khiết - gọi là alcaloid toàn phần Sơ đồ chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu c ơ •Ưu điểm - Dịch chiết sạch, dễ tinh chế loại các tạp kèm theo do đó hiệu suất chiết cao. 11 - Dm hữu cơ không phân cực thường có khả năng chiết chọn lọc với các alcaloid base. • Nhược điểm - Dm hữu cơ thường đắt tiền, dễ cháy. - Sử dụng dm hữu cơ đòi hỏi phải có thiết bị kín đ hơi dm, có biện pháp thu hồi dm do đó đầu tư cho thiết bị lớn. • ứng dụng Phương pháp này được dùng phổ biến trong chiết xuất alcaloid, đặc biệt với các dược liệu có nhiều chất nhày, pectin, tinh bột... dễ trương nở trong nước. b - Chiết xuất alcaloid base bằng dm hữu cơ phân cực ịethanol, methanol... Do dm hữu cơ phân cực ethanol, methanol... hoà tan alcaloid ở cả dạng muối và dạng base nên có thể sử dụng để chiết alcaloid dưới dạng base. Tuy nhiên nếu dùng dm phân cực để chiết alcaloid thì tuỳ vào bản chất của dược liệu mà dịch chiết có thể kéo theo nhiều tạp chất hơn so với sử dụng dm hữu cơ không phân cực. Và trong khâu tinh chế không thể chuyển trực tiếp alcaloid base sang dạng muối bằng cách dùng nước acid để chiết alcaloid từ pha dm hữu cơ chiết lỏng/lỏng mà phải cất thu hồi dm trước khi chuyển sang dạng muối và chiết bằng nước hoặc dùng một dm không phân cực chiết nó từ dịch cô đặc sau khi loại dm chiết. - Chiết xuất alcaloid dưới dạng muối muối tự nhiên hoặc muối với acid vô cơ bằng dm nước, nước acid hoặc các dm phân cực khác - Giai đoan 1 Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô như phương pháp Sau đó làm ẩm dược liệu cho trương nở bằng nước. - Giai đoan 2 Chiết xuất Dùng dm nước để chiết alcaloid ở dạng muối tự nhiên trong cây hoặc dùng dung dịch acid loãng để chiết alcaloid dưới dạng muối với acid vô cơ tương ứng, hoặc dùng dm là methanol và ethanol để chiết xuất alcaloid dưới dạng muối tự nhiên. - Giai đoan 3 Tinh chế Trong trường hợp chiết bằng nước, từ dịch chiết thô alcaloid base được giải phóng bằng cách thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dm hữu cơ không hoà tan 12 trong nước. Tiếp tục tinh chế bằng cách bốc hơi dm và kết tinh lại trong dm hữu cơ hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. Trong trường hợp chiết bằng ethanol, dịch chiết ethanol được cô đặc, thêm acid và loại các tạp chất bằng các dm hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alcaloid sang dạng base rồi chiết alcaloid base bằng một dm hữu cơ thích hợp. Bốc hoi dm hữu cơ, kết tinh alcaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. • Ưu điểm - Dm rẻ tiền, dễ kiếm. - Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít. • Nhược điểm - Dịch chiết thường lẫn nhiều tạp do đó khó tinh chế, hiệu suất thấp. - Với những dược liệu có nhiều chất nhầy, pectin, tin nước trương nở, làm tăng độ nhớt do đó khó chiết, khó rút dịch chiết. • ứng dụng Với các dược liệu có ít tạp tan trong nước, trong dung môi phân cực. Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối vói phần lớn các alcaloid trong dược liệu, nhưng một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước ephedrin, colchicin... hoặc ở dạng muối ít tan trong nước berberin clorid... tan trong dm hữu cơ resecpin hydroclorid tan trong cloroform thì người ta phải có cách chiết riêng cho thích hợp. - Các phương pháp tách alcaloid dưói dạng tinh khiết Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần thu được ở giai đoạn tinh chế để tách riêng từng alcaloid dưới dạng tinh khiết có nhiều phương pháp khác nhau như thăng hoa, cất, giải phóng phân đoạn, kết tinh phân đoạn, sắc ký hấp phụ... Tuỳ vào tính chất của alcaloid cần tách mà lựa chọn phương pháp thích hợp. - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền - phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam - Strychnin đã được chiết xuất công nghiệp từ lâu và phương pháp mà xí nghiệp 2 thực hiện là chiết nóng với dm dầu hoả, dịch chiết sau đó được khuấy với dd H2S04 3% và gạn thu lấy lớp acid, dm đem thu hồi để chiết tiếp mẻ sau. Lớp acid được kiềm hóa bằng dd Na2C 0 3 bão hoà để tạo tủa alcaloid toàn phần. Lọc thu lấy tủa, rồi tiến hành loại brucin bằng cách chuyển sang dạng muối nitrat, strychnin 13 nitrat kết tinh còn brucin nitrat thì ở trong nước cái. Lọc thu lấy tinh thể strychnin nitrat đem tẩy màu bằng than hoạt, sau đó chuyển sang dạng muối sulíat. [2] - Quy trình thực tập trước đây của bộ môn Công nghiệp dược là dùng benzen để chiết xuất tiến hành tương tự như chiết bằng dầu hoả như trên nhưng chiết nguội. [3] - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói Quy trình của tác giả p. H. List và cộng sự Các tác giả chiết strychnin base bằng dm hữu cơ phân cực rồi cô thu hồi dm và tách strychnin dưới dạng muối HN03. [10] 14 PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm - Nguyên vật liệu - Nguyên liệu Hạt Mã tiền Strychnos nux -vomica L. đã được phơi khô. - Hoá chất và dm - Ethanol. - Dầu hoả. - Sữa vôi. - Na2C 0 3. - H2S04. - H N 03. - Cloroform. - Và các hoá chất khác HC1, NaOH, acid acetic,.. .• - Trang thiết bị - Dụng cụ chiết nóng. - Bình gạn 500 ml. - Máy quang phổ u v - VIS. - Máy cất thu hồi dm. - Máy siêu âm. - Máy đo góc quay cực. - Tủ sấy. - Các dụng cụ khác Bếp điện, cốc có mỏ, ống đong, bình gạn 125 m l,... - Phương pháp thực nghiệm - Định lượng strychnin trong hạt Mã tiền Bằng phương pháp đo quang theo DĐVNIII. Cân chính xác khoảng 0,4g dược liệu qua rây số 355 vào bình nón nút mài lOOml. Thêm chính xác 20ml cloroíorm và 0,3ml amoniac đậm đặc. Đậy kín bình 15 Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Độc chất trong cây mã tiền", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trênNội dung text Bài giảng Độc chất trong cây mã tiềnĐỘC CHẤT TRONG CÂY MÃ TIỀN Strychnine and Brucine Strychnos nux-vomicaCác nội dung chính 1. Nguồn gốc 2. Đường dùng gây độc 3. Độc tính 4. Cơ chế gây độc 5. Triệu chứng 6. Giải độc và điều trị 7. Kiểm nghiệm chất độc1. Nguồn gốc  Cây Mã tiền có chủ yếu ở Ấn Độ và ĐNA  Strychnine và brucine được tìm thấy trong Strychnos nux- vomica Fam. Loganiaceae  Trong hạt mã tiền có 15% manna, 85% ga-lactan. 4-5% chất béo, bột heterozid gọi là loganozid hay loganin 1,5%, rất nhiều alcaloid trong đó chủ yếu là strycnine, brucine.  Tỷ lệ alcaloid toàn phần trong mã tiền thay đổi từ 2,5 đến 5,5%, trong đó strychnine chiếm 43-45%.2. Đường ngộ độc, nguyên nhân gây ngộ độc  Trong dân gian mã tiền được dùng dưới dạng bột, dạng hạt hoặc ngâm rượu như một vị thuốc nam. Nguyên nhân2. Đường ngộ độc, nguyên nhân gây ngộ độc tiếp Đường tiêu hóa - Ăn phải quả, hạt cây mã tiền. - Uống phải rượu ngâm Mã dụng thuốc an toàn ❑Trong ngành dược dùng bột của hạt mã tiền để bào chế thành rượu mã tiền 0,25% alcaloid, cao mã tiền 16% alcaloid toàn phần. ❑ Việc sử dụng thuốc liên quan đến strychnine và brucine cần phải được giám sát chặt Độc tính ❑Tác dụng dược lý ➢Kích thích thần kinh TW. ➢Có tác dụng giảm đau. ➢Strychnine kích thích các nueron đệm của tủy. ➢kích thích não và hành não. ➢Kích thích hô hấp, tuần hoàn và tiêu Độc tính ❑Độc tính ➢Mã tiền có độc tính rất cao, thuốc độc bảng A. ➢LD của strychnine cho người lớn là 0,05g ➢Liều cao gây co giật , liệt hô hấp, co cứng cơ. ➢Nạn nhân tử vong do ngạt Cơ chế gây ngộ độc Strypchnine là chất đối kháng glycine-một chất ức chế dẫn truyền thần kinh quan trọng trong hệ thần kinh động vật có Cơ chế gây ngộ độc tiếp4. Cơ chế gây ngộ độc tiếp  Strychnine liều cao kích thích cả vỏ não và hành não.  Làm tăng biên độ và tần số hô hấp.  Tăng tuần hoàn khi các trung tâm này bị ức chế.  Kích thích mạnh tủy sống gây co giật giống như co giật uốn ván.  Gây co cứng cơ, tăng phản xạ gân xương, tăng trương lực cơ, xoắn vặn, giật các bó Triệu chứng  Sau uống 15-30phút, biểu hiện rất đặc trưng, bệnh nhân rất dễ bị kích thích tiếng động, âm thanh, ánh sáng, .  Ngáp, tăng tiết nước bọt.  Co cứng toàn thân như bị uốn ván  Co cứng cơ miệng gây khó há miệng, khó nói.  Lo lắng và bồn chồn, co thắt bắp thịt gây khó thở.  Bệnh nhân dễ lên cơn co giật khi bị kích thích.  Cái chết có thể xảy ra vì kiệt sức, hoặc liệt hô Giải độc và điều trị  Chưa có thuôc điều trị đặc hiệu.  Để bệnh nhân yên tĩnh trong bóng tối, tránh tiếng động.  Tiêm apomorphin để gây nôn, tiêm truyền huyết thanh mặn ưu trương để loại bỏ strypchnine qua nước tiểu.  Rửa dạ dày bằng dd KMnO4  Kích thích hô hấp bằng cách tiêm tĩnh mạch phenolbarbiturat.  Hô hấp nhân tạo, thở oxy để chống NGHIỆM STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG CÂY MÃ TIỀN Strychnos nux-vomicaKIỂM NGHIỆM PP HIỂN VI PP HÓA HỌC DƯỢC VI SOI ĐỊNH ĐỊNH LIỆU PHẪU BỘT TÍNH LƯỢNGI. PHƯƠNG PHÁP HIỂN VI 1. ĐẶC ĐIỂM DƯỢC LIỆU  Hạt hình dẹt, mép hơi dầy hơn, thường hơi méo mó, màu xám nhạt đến vàng nhạt.  Mặt bóng, có một lớp lông tơ mượt từ giữa mọc tỏa ra xung quanh, giữa một mặt có một chỗ lồi nhỏ, từ rốn có một đường hơi lồi chạy đến 1 chỗ nhô lên ở mép ĐẶC ĐIỂM VI PHẪU  Vỏ hạt gồm vài lớp tế bào rất dày, nhìn không rõ tế bào  Ngoài lớp vỏ có 1 lớp lông có gốc phình to ra thành rất dày, ở vách có những kẽ nứt nghiêng  Lông phàn đầu xếp nghiêng tạo thành 1 lớp dầy, gồm nhiều sợi nhỏ xếp sít nhau  Nội nhũ gồm những tế bào nhiều cạnh, có chứa dầu và hạt aleuron 1. Biểu bì 2. Lông che chở 3. Nội nhũ3. ĐẶC ĐIỂM BỘT  Bột màu xám sáng  Quan sát dưới kính hiển vi - Rất nhiều đoạn lông gãy hình đũa, rời từng đoạn hay dính với nhau thành bó - Chân lông hình nậm, rời hoặc dính với nhau - mảnh nội nhũ gồm tế bào bóng, thành dày, một vài tế bào chứa dầu và aleuron - Tế bào cứng của lớp vỏ có thành uốn lượn, có nhiều ống nhỏ. 1. Mảnh lông gãy 2. Mảnh nội nhũ 3. Nội nhũ 4. Chân lông hình nậmII. PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC 1. CHUẨN BỊ MẪU CHIẾT ALCALOID TỪ HẠT MÃ TIỀN  Cân bột mã tiền vào bình nón, thêm dung dịch acid H2SO4 1N  Đun sôi để nguội  Lọc dịch lọc vào bình gạn  Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH = 9 -10  Chiết alcaloid bằng ether hoặc cloroform  Gộp các dịch chiết, loại nước bằng Na2SO4 khan  Chia dịch chiết ra các ống nghiệm nhỏ để tiến hành thí nghiệm2. ĐỊNH TÍNH ALCALOID TRONG HẠT MÃ TIỀN a. Định tính alcaloid bằng thuốc thử chungb. Phản ứng tìm strychnin TN 1 H2SO4 đđ + tt K2Cr2O7 TN 2 Thuốc thử mandelinTN 3. Thử co giật trên ếchc. Phản ứng tìm brucine HNO3 đặcd. Định tính Strychnin và Brucin bằng sắc kí lớp mỏng DM khai triển Toluen- Aceton- Silicagel GF254 Ethanol- Amoniac = 4 5 0,6 0,4 Hiện màu bằng TT Dragendorff → so với chất chuẩnSắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ➔ kết hợp định tính và định lượng2. ĐỊNH LƯỢNG a. HPTLC Dựa vào chiều cao, diện tích pic Figure 6 HPTLC chromatogram of Strychnos nux-vomica seed showing strychnine and brucineb. Đo quang  Cân chính xác 0,4 g dược liệu qua rây 355 vào bình nón nùt mài 100 ml. Thêm chính xác 20 ml cloroform và 0,3 ml amoniac đđ. Đậy kín bình và cân. Đun hoàn lưu trên cách thủy trong 3 giờ, hoặc 45 phút trong bể siêu âm 350 W, 35 kHz. Cân bổ sung lượng cloroform hao hụt. Lắc đều, lọc nhanh vào bình nón. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình gạn 50 ml. Chiết 4 lần mỗi lần 10 mL dung dịch acid sulfuric 0,5 M. lọc dịch acid qua giấy lọc đã thấm ướt trước bằng dung dịch acid sulfuric 0,5 M vào một bình định mức 50 ml. Rửa giấy lọc bằng một lượng nhỏ dung dịch acid sulfuric 0,5 M, gộp dịch rửa vào bình định mức và thêm cùng dung môi cho tới vạch, lắc kỹ. Hút chính xác 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml pha loãng vừa đủ bằng dd acid sulfuric 0,5 M. lắc đều.  Xác định độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 262 nm và 300 nm. Cốc đo dày 1 cm, so với mẫu trắng là dung dịch acid sulfuric 0,5 M.  Hàm lượng strychnin được tính theo công thức 5 0,321a – 0,467b % strychnin = m 1 –X  Trong đó a độ hấp thu ở 262 nm b độ hấp thu ở 300 nm m khối lượng mẫu thử g X độ ẩm của dược liệu gb Định lượng Phương pháp đo quang Figure 4 Superimposed UV spectra of strychnine standard with samples showing γ max at 259 nmb Định lượng Figure 5 Superimposed UV spectra of brucine standard with samples showing γ max 306 nmTùy trường hợp mà có phương pháp kiểm nghiệm thích hợp →Đối tượng tử thi → mẫu phân tích dịch sinh học → PPKN • Hiển vi • Hóa học định tính và định lượng→ đối tượng bệnh nhân ngộ độc → dựa vào triệu chứng lâm sàng → mẫu phân tích • Dịch sinh học • Mẫu thức ăn, chế phẩm bệnh nhân sử dụng → PPKN hiển vi tìm lông mã tiền => cấp cứu→ định tính pp hiển vi → định tính pp hóa học → Định lượng pp hóa học → Định lượng pp hóa họcThank you for watching! ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9130.2018 71 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BRUCIN VÀ STRYCHNIN TỪ HẠT MÃ TIỀN CHẾ BẰNG HPLC STUDY ON EXTRACTION METHOD AND DETERMINATION OF BRUCINE AND STRYCHNINE FROM STRYCHNOS NUX-VOMICA BY HPLC Giang Thị Kim Liên1, Trần Ngọc Đông2, Nguyễn Thị Hoàng Anh3 1 Đại học Đà Nẵng; gtklien 2 Trường Cao đẳng Nguyễn Văn Trỗi 3 Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tóm tắt - Mã tiền Strychnos nux-vomica được biết là nguồn chính của các alkaloid có độc tính cao như strychnin C21H22N2O2 và brucin C23H26N2O4, sử dụng trong y học. Nghiên cứu chiết tách, đánh giá hàm lượng của brucin và strychnin, hai alkaloid quan trọng trong Mã tiền chế là cơ sở cho việc sử dụng hiệu quả vị thuốc này. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phương pháp chiết brucin và strychnin bằng 3 phương pháp khác nhau. Đánh giá định tính brucin và strychnin trong 3 dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi CH2Cl2MeOH = 50,6, phát hiện các chất bằng cách soi đèn tử ngoại, phun với thuốc thử Dragendoft, thuốc thử vanilin/H2SO4. Hàm lượng brucin và strychnin được phân tích bằng phương pháp lập đường chuẩn với thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Abstract - Strychnos nux-vomica is known to be the main source of highly toxic alkaloids such as strychnine C21H22N2O2 and brucine C23H26N2O4, which are used in medicine. Study on the extraction, evaluation of the content of brucin and strychnin, two important alkaloids, extracted from Strychnos nux-vomica seeds is the basis for effective using of this drug. This article shows the results of extraction of total alkaloid by three different methods, qualitative evaluation of brucins and strychnin in three extractions by thin-layer chromatography method with the solvent of CH2Cl2MeOH=5 detecting substances by ultraviolet light, spraying with Dragendoft reagent and vanillium /H2SO4 reagent, quantitative evaluation by high performance liquid chromatography HPLC methods. Từ khóa - Strychnos nux-vomica; brucin; strychnin; alkaloid; sắc ký lỏng hiệu năng cao. Key words - Strychnos nux-vomica; brucine; strychnine; alkaloid; HPLC. 1. Đặt vấn đề Mã tiền Strychnos nux-vomica được biết là nguồn chính của các alkaloid có độc tính cao như strychnin C21H22N2O2 và brucin C23H26N2O4, sử dụng trong y học. Hạt của nó chứa khoảng 1,5% strychnin, còn hoa khô chứa khoảng 1,023% [1, 2]. Trong hạt Mã tiền có 15% manan, 85% galactan, 4-5% chất béo, một heterosid gọi là loganosid hay loganin 1,5%. Hạt Mã tiền chứa khoảng từ 2,6-3% alkaloid tổng, trong đó strychnin 1,25-1,5% và brucin 1,7% là hai alkaloid chính. Ngoài ra, các alkaloid phụ gồm có vomicin, igasurine [3], α-colubrine, β-colubrine, N-oxystrychnin, 3-methoxyicajine, isostrychnine, protostrychnine, pseudostrychnine, novacine [4]. Bên cạnh alkaloid, các hợp chất khác như loganin, chlorogenic acid cũng được tìm thấy trong hạt Mã tiền. Hạt Mã tiền không được sử dụng làm thuốc uống trong y học do hàm lượng strychnin cao. Do vậy hạt Mã tiền phải được chế biến để loại bớt thành phần alkaloid strychnin tạo ra Mã tiền chế giảm bớt độc tính và có tác dụng điều trị bệnh. Có nhiều cách để tạo Mã tiền chế ví dụ như hạt quả cây Mã tiền được ngâm vào nước vo gạo khoảng 36 giờ, đến khi mềm cạo vứt bỏ vỏ ngoài và mầm, sau đó thái mỏng, sấy khô tẩm dầu mè một đêm, sao đến màu vàng đậm rồi cho vào lọ đậy kín [5]. Thuốc Phong tê thấp Bà Giằng là một bài thuốc chữa bệnh viêm khớp dạng thấp được lưu truyền rộng rãi và lâu đời trong người dân Thanh Hóa cũng như người dân cả nước. Mã tiền chế là một vị thuốc quan trọng có tính quyết định trong bài thuốc này. Cho đến nay bài thuốc được bào chế dưới dạng viên hoàn, tức là các dược liệu kể cả Mã tiền chế được xay thành bột nhỏ, phối trộn với tá dược để tạo ra viên hoàn. Nhằm hiện đại hóa bài thuốc gia truyền này, việc chuyển dạng bào chế thành viên nang cứng dễ sử dụng, dễ bảo quản và tiêu chuẩn hóa, từ các cao chiết dược liệu là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Trong đó nghiên cứu phương pháp chiết, đánh giá hàm lượng của brucin và strychnin trong Mã tiền chế là một nhiệm vụ quan trọng. Bài báo này công bố kết quả nghiên cứu 3 phương pháp chiết Mã tiền chế; đánh giá định tính brucin và strychnin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, định lượng chúng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 2. Thực nghiệm Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị - Bột Mã tiền chế do Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất Thuốc y học cổ truyền Bà Giằng cung cấp. - Ethanol thực phẩm, nước cất, HCl, H2SO4, NH4OH, Na2SO4 tinh khiết, thuốc thử Dragendoft, thuốc thử Vanilin/H2SO4. - Hệ thống thiết bị HPLC Alliance series 2695, detector PDA 2996 của hãng Waters-Mỹ. - Cân phân tích Adam AAA 160L. Chiết mẫu hạt Mã tiền chế Việc chiết mẫu được thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau [6, 7]. a. Chiết với Ethanol 96° - Nước 1 Ngâm chiết 2 kg bột Mã tiền chế với 10 lít ethanol 96° trong 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, lọc thu được 6 lít dịch chiết. - Nước 2 Tiếp tục ngâm bã Mã tiền chế với 6 lít ethanol 96° trong 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, lọc thu được 4 lít dịch chiết. - Nước 3 Bã Mã tiền chế được tiếp tục ngâm chiết với 6 lít ethanol 96° trong 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, lọc thu được 4 lít dịch chiết. Giang Thị Kim Liên, Trần Ngọc Đông, Nguyễn Thị Hoàng Anh 72 Gộp dịch chiết của các lần chiết 1 + 2 + 3 quay cất dưới áp suất giảm để thu cặn chiết, ký hiệu MTE. b. Chiết với ethanol 70° Bằng cách tương tự như trên, ngâm chiết 2 kg bột Mã tiền chế 3 lần với ethanol 70° 10; 6 và 6 lít, mỗi lần 3 tiếng ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết, lọc, quay cất dưới áp suất giảm để thu cặn chiết, ký hiệu MTEN. c. Tách alkaloid tổng Ngâm chiết 2 kg bột Mã tiền chế với 13 lít dung dịch HCl 0,5M, lọc thu dịch chiết. Chiết với n-hexan để loại các chất kém phân cực, kiềm hóa pha nước thu được bằng dung dịch NH4OH 25% đến pH = 12, chiết 5 lần với CH2Cl2 mỗi lần 2 lít. Gộp dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cặn chiết, ký hiệu MTH. Đánh giá định tính và định lượng alkaloid strychnin và brucin a. Đánh giá định tính bằng phương pháp TLC Các cặn chiết MTE, MTEN và MTH được đánh giá định tính bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi CH2Cl2MeOH = 50,6, phát hiện các chất bằng cách soi đèn tử ngoại, phun với thuốc thử Dragendoft, thuốc thử vanilin/H2SO4 b. Định lượng bằng phương pháp HPLC - Xây dựng đường chuẩn Brucin và strychnin chuẩn Merck được cân chính xác 25 mg cho vào bình định mức 25 ml sau đó thêm MeOH cho đến vạch ta được dung dịch gốc. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,01; 0,1; 0,2; 0,3 và 0,5 mg/ml, sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống HPLC với cột phân tích Sunfire -C18 RP x 250 mm, 5µm. - Thông số của HPLC Pha động Kênh A H2O + 0,1% acid formic; Kênh B Acetonitrile. Tốc độ dòng 1 ml/phút, chạy gradient kênh A từ 80% về 0% trong 30 phút. Detector PDA bước sóng 264 nm brucin; 253,4 nm strychnin. Các nồng độ brucin và strychnin chuẩn đã được đo lặp lại 3 lần, kết quả thu được có sự ổn định rất cao về giá trị tích phân diện tích pic, và thời gian lưu RT. Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp đã lựa chọn cho hệ thống HPLC là phù hợp cho việc phân tích định lượng brucin và strychnin. Kết quả đánh giá định tính strychnin và brucin Hình ảnh các vệt sắc ký của 3 cặn chiết MTE, MTEN, MTH so sánh với strychnin St và brucin Br trên bản mỏng hiện với các phương pháp khác nhau, được trình bày trên Hình 1, 2 và 3. Hình 1. Vệt sắc ký hiện dưới đèn tử ngoại Hình 2. Vệt sắc ký hiện với thuốc thử Vanilin/H2SO4 3. Kết quả và thảo luận Hiệu suất chiết mẫu bằng ba phương pháp Bảng 1. Hiệu suất chiết mẫu Bột Mã tiền Cặn chiết Hiệu suất chế kg g chiết % STT Phương pháp 1 Chiết với ethanol 96° 2 306,25 15,31 2 Chiết với ethanol 70° 2 374,06 18,70 3 Chiết alkaloid tổng 2 216,92 10,85 Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả trung bình được trình bày trên Bảng 1. Kết quả trên Bảng 1 cho thấy phương pháp chiết bột Mã tiền chế với ethanol 70° cho lượng cặn chiết với hiệu suất cao nhất. Hình 3. Vệt sắc ký hiện với thuốc thử Dragendoft Nhận xét Các bản mỏng trên cho thấy các cặn chiết MTH, MTE, MTEN đều có chứa strychnin, brucin và một số alkaloid khác với hàm lượng nhỏ. Ngoài các hợp chất alkaloid, cặn chiết MTE có chứa một số chất kém phân cực, trong khi cặn chiết MTEN chứa các hợp chất phân cực. Đây chỉ là các kết quả định tính, phương pháp HPLC sẽ cho biết hàm lượng 2 alkaloid quan trọng này trong các cặn chiết Mã tiền chế. ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9130.2018 Kết quả đánh giá định lượng alkaloid brucin và strychnin Xây dựng đường chuẩn cho brucin và strychnin Kết quả phân tích HPLC cho dãy chuẩn của brucin và strychnin được trình bày trên Bảng 2 và Bảng 3, từ kết quả này sẽ tiến hành xây dựng đường chuẩn. Bảng 2. Kết quả phân tích HPLC cho chất brucin Nồng độ mg/ml 0,01 0,1 0,2 0,3 0,5 TT 1 2 3 4 5 Diện tích pic 147933 1804838 3663515 5579296 9745037 Diện tích Pic LT 38785 1800297 3757532 5714768 9629239 RT phút 6,4 6,4 6,4 6,4 6,4 73 Bảng 3. Kết quả phân tích HPLC cho chất strychnin TT 1 2 3 4 5 Nồng độ mg/ml 0,01 0,1 0,2 0,3 0,5 Diện tích pic 79773 1165872 2393406 3579914 6308848 Diện tích pic LT 18247 1159089 2426690 3694292 6229495 RT phút 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 Từ kết quả Bảng 2 và 3, dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu phương pháp hồi quy tuyến tính cấp một để xác định các tham số của phương trình hồi quy y = ax + b. Kết quả phân tích phương sai cho các chất brucin và strychnin được trình bày trên Bảng 4 và Bảng 5. Bảng 4. Bảng phân tích phương sai cho brucin SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9995 R Square 0,9990 Adjusted R Square 0,9987 Standard Error 132331,7 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F 3143,075467 1,25009E-05 P-value Lower 95% Regression 1 5,50405E+13 5,50405E+13 Residual 3 52535025563 17511675188 Total 4 Coefficients Intercept Nong do Bru mg/ml 5,50931E+13 Standard Error t Stat Upper 95% Lower 99,0% Upper 99,0% -156939 97514 -2 0,205905 -467273 153395 -726512 412634 19572355 349113 56 0.,000013 18461323 20683388 17533220 21611491 Bảng 5. Bảng phân tích phương sai cho strychnin SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,99947 R Square 0,99895 Adjusted R Square 0,99860 Standard Error 90034,2 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F 2848,0458 1,45E-05 Regression 1 2,30867E+13 2,30867E+13 Residual 3 24318461215 8106153738 4 2,3111E+13 Total Coefficients Standard Error Intercept Nong do Stry mg/ml t Stat P-value Lower 95% -108513 66346 -1,6356 0,200447 -319654 102628,6 -496031 279006 12676015 237525 53,3671 1,449E-05 11920105 13431926 11288653 14063377 Kết quả phân tích phương sai cho brucin cho thấy hệ số tương quan R = 0,9995. Phương trình hồi quy tuyến tính đối với brucin được xác định là Y = 19572355. xi – 156939. Đồ thị đường chuẩn brucin được trình bày trên Hình 4. Upper 95% Lower 99,0% Upper 99,0% Kết quả phân tích phương sai cho strychnin cho thấy hệ số tương quan R = 0,99947. Phương trình hồi quy tuyến tính đối với strychnin được xác định là Y = 12676015. xi – 108513. Đồ thị đường chuẩn strychnin được trình bày trên Hình 5. Giang Thị Kim Liên, Trần Ngọc Đông, Nguyễn Thị Hoàng Anh 74 cũng được thực hiện với cùng điều kiện như mẫu chuẩn. Duong chuan Brucin 12000000 10000000 Dien tich pic 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0 Nong do mg/ml Series1 Hình 4. Đường chuẩn brucin Duong chuan Strychcin 7000000 6000000 Dien tich pic 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0 Nong do mg/ml Series1 4. Kết luận Hàm lượng hai alkaloid brucin và strychnin thu được từ quy trình chiết 3 là cao nhất, nhưng hiệu suất chiết của quy trình thứ 2 cao hơn quy trình 3. Do vậy, lượng hai alkaloid thu được từ hai quy trình chiết 2 và 3 gần tương đương. Các kết quả này cho thấy để chiết xuất các hoạt chất từ bột Mã tiền chế làm nguyên liệu sản xuất thuốc Phong tê thấp Bà Giằng dạng viên nang cứng thì điều kiện chiết xuất phù hợp nhất là nhiệt độ phòng, dung môi ethanol 70°. Hàm lượng brucin trong 3 dịch chiết MTE, MTEN và MTH tương ứng là 0,63%; 0,85% và 0,79%. Hàm lượng strychnin trong 3 dịch chiết MTE, MTEN và MTH tương ứng là 0,94%; 1,20% và 1,07%. Lời cảm ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi Dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cao khô bán thành phẩm và thuốc Phong tê thấp Bà Giằng”, mã số CNHD. DASXTN 024 thuộc Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp Hoá dược đến năm 2020 do Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất thuốc Y học cổ truyền làm chủ trì, phối hợp với Viện Hóa học thực hiện. Hình 5. Đường chuẩn Strychnin Kết quả phân tích hàm lượng brucin và strychnin Từ các số liệu thu được ở Bảng 2 và 3, dựa vào các phương trình hồi quy thu được từ phương pháp lập đường chuẩn, đã xác định được hàm lượng brucin và strychnin trong bột Mã tiền chế với 3 phương pháp chiết khác nhau nêu trên, kết quả được trình bày ở Bảng 6. Bảng 6. Hàm lượng brucin và strychnin Hàm lượng Hàm lượng brucin % strychnin % TT Dịch chiết 1 MTE Chiết với ethanol 96° 0,63 0,94 2 MTEN Chiết với ethanol 70° MTH Chiết alkaloid tổng 0,85 1,20 0,79 1,07 3 Như vậy, với sự ổn định của việc lặp lại các lần đo cộng thêm sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ brucin, strychnin và diện tích pic thu được trên phổ HPLC, phương pháp này tối ưu cho việc phân tích định lượng brucin và strychcin trong các mẫu nghiên cứu. Các mẫu phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chinese Plant Names, Strychnos nux-vomica. Linnaeus Sp. pp. 325. [2] Arnold M. D., Harry L., Poisonous Plants of Hawaii, Tokyo, Nhật Bản, 1968. [3] Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Thời đại, 2004, trang 529. [4] Anil Sah, Gopal L. Khatik, Manish Vyas, Pramod Yadav, “A Short Review on Anticancer Inves of Strychnos nux-vomica”, International Journal of Green Pharmacy, 103, S88, 2016, pp. 87-90. [5] [6] Pasupuleti Sreenivasa Rao, Majeti Narasimha Vara Prasad, “Extraction, Purification and Characterization of Indole Alkaloids from Strychnos wallichiana L. – an Endangered Medicinal Plant from India”, Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 2008, pp. 63-66. [7] Jun Chen, Yange Qu, Dongyue Wang, Pei Peng, Hao Cai, Ying Gao, Zhipeng Chen, Baochang Cai, “Pharmacological Evaluation of Total Alkaloids from Nux Vomica Effect of Reducing Strychnine Contents”, Molecules, 19, 2014, pp. 4395-4408. BBT nhận bài 8/8/2018, hoàn tất thủ tục phản biện 21/8/2018

định lượng strychnin trong hạt mã tiền